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技术文章
非接触式超声波破碎仪在染色质免疫沉淀技术中的应用

    非接触式超声波破碎仪主要用于无菌破碎细胞,隔着离心管能打断染色体,可在密封容器下进行破碎,超声波探头与样品不接触,避免交叉污染。可选配冷却水循环系统,便于样品在4℃水浴超声,能量分布均匀,超声作用完全,实验重复性好,结果可靠性高。

    真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP )是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。

    染色质免疫共沉淀(CHIP)的原理:

    是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片段的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

   CHIP实验步骤:

1、细胞固定

   甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。交联所用的甲醛终浓度为1%,交联时间通常为5分钟到1个小时。需注意的是,交联时间如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

2、染色质片段化

   交联后的染色质需被超声波切成400~600bp的片段,以便目的蛋白的暴露,利于抗体识别,其片段破碎的均匀一致性对结果影响至关重要。传统的超声波破碎是利用机械力断裂染色质,容易引起升温或产生泡沫,这都会引起蛋白质变性,进而影响ChIP的效率。而非接触式超声波破碎仪采用温和的破碎方式,保证了蛋白的活性,DNA破碎效果均一,同时外接水循环仪保证了实验的温度稳定性,成为目前ChIP实验的优先考虑设备。

3、染色质免疫沉淀反应

Input对照:

在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联,DNA纯化,以及zui后的检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果,还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的建议靶序列的含量,按照取样比例换算出ChIP的效率,所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。

Beads选择:

接下来,利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体特异反应形成DNA-蛋白质-抗体复合物,然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此复合物,特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次洗涤,除去非特异结合的染色质后,用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。

抗体选择:

染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时,抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近,不能被抗体识别,所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物,直接影响ChIP的结果。

阴性对照设置:

在做ChIP实验时,需设置对照,以便于对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体,常用的包括组蛋白抗体或RNAPolymerase II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较,才能得出正确结论。另外,还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能,所以通常还会选择一对阴性引物,即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列,作为该抗体的阴性对照。较优的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体,只有其他用途的抗体时,可以先做蛋白质免疫沉淀检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白,再进行染色质免疫沉淀实验的检测。

4、交联反应的逆转和DNA的纯化

   用不含DNase的RNase和Proteinase K,65℃保温6小时逆转交联,经DNA纯化柱回收DNA抽提、乙醇沉淀纯化DNA。在逆转交联时不使用Proteinase K,然后用丙酮回收有机相中的蛋白质,进行分析。

5、DNA的鉴定

   常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于启动子区域序列多样性的特点,所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能不同,因此可设计多对引物来反复验证ChIP实验的结果。

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